蜂毒肽可以人工生物合成了 !

2021-03-25


 

蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表达


蜂毒肽又称蜂毒溶血肽,是蜂毒的主要活性成分之一,在抗菌、消炎、抗肿瘤乃至肌肉再生等方面具有一定应用价值。目前基因工程技术为蜂毒肽生产提供了新的途径,但从研究到生产仍有一定距离。

蜂毒前溶血肽原是prepromelittin基因的表达产物,在蜜蜂体内合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前体蛋白,promelittin),这是蜂毒肽的前体形式,可被进一步水解而形成蜂毒肽。蜂毒前溶血肽原由70个氨基酸残基构成,其结构主要包括信号肽(1~21 aa,aa为氨基酸个数的缩写)、低复杂性区域(22~43 aa)和蜂毒肽结构域(44~69 aa)。与蜂毒肽相比,蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度,且对细胞的破坏能力小,可以考虑作为利用基因工程方法在体外合成蜂毒肽的初始产物。

为进一步探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,根据大肠杆菌密码子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等对蜂毒前溶血肽原基因序列进行改造,并利用人工化学合成方法完成改造后全基因的合成。

构建蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后分别在20、37 ℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western Blot对产物进行检测。

结果表明,表达体系成功表达了目的融合蛋白,在20 ℃条件下可获得可溶性表达产物,为进一步分离纯化目的蛋白及获得蜂毒肽提供了基础。

 

讨论与结论

利用人工化学合成技术获得全基因序列为基因的改造提供了方便。这种方法既可以缩短合成周期,又为序列的正确性提供了保障。同时,在进行原核表达时,可以有效地根据原核生物密码子偏好性及其他需要对目的片段的基因序列进行优化及定点突变,密码子的优化将有利于目的基因在宿主细胞内高效精确地表达。

蜂毒前溶血肽原基因CDS序列全长仅213 bp,可以按一定原则对其进行充分改造,再利用上述方法将其合成,使之满足在不同细胞内表达的需要。

对基因序列进行改造过程中考虑到应用羟胺裂解方法对GST-蜂毒前溶血肽原融合蛋白进行处理以获得蜂毒肽,所以在原序列上添加了相应氨基酸对应的密码子(AAC),使表达产物中蜂毒肽结构域前形成羟胺裂解位点(Asn-Gly)。

若考虑通过其他酶或化学物质从表达产物上将蜂毒肽切割下来,可以设计其他相应密码子,如利用肠激酶作用位点时,可在蜂毒前溶血肽原基因中蜂毒肽对应的序列首密码子前添加GAC GAC GAC GAC AAG序列。

已知多种酶或化学试剂在蜂毒前溶血肽原上没有切割位点或在蜂毒肽结构域没有切割位点,可以按照此思路在蜂毒肽前溶血肽原基因中相应位置添加对应的密码子序列。

利用基因工程技术生产蜂毒肽被看作是获得蜂毒肽的新途径,研究者关注蜂毒肽对细胞的毒性,探索利用融合蛋白等方式实现蜂毒肽在原核细胞、真核细胞中的表达。

考虑到蜂毒肽在蜜蜂体内以其前体蛋白蜂毒前溶血肽原的形式表达,笔者设计了蜂毒前溶血蛋白原的全基因序列,期望以此降低其对细胞的破坏作用。为了便于从表达产物中分离目的蛋白,选择了利用GST融合蛋白的形式进行表达。

构建的蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel能够在不同温度下进行表达,其在20 ℃条件下表达的目的蛋白一部分以可溶性蛋白的形式存在,为进一步分离纯化表达产物并进行切割以获得有活性的目的蛋白提供的方便。

但由于GST标签自身相对分子质量较大,而设计的目的蛋白又非常小,对相关下游试验可能会有较大影响。考虑到设计的目的蛋白蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度,对细胞膜的破坏能力较低,也可以尝试使用分子量较小的His标签。

蜂毒前溶血肽原本身具有信号肽结构,若有好的无标签分离纯化目的蛋白的方法,也可以尝试直接表达蜂毒前溶血肽原。而有关其表达量的提高及表达产物的处理等仍需进一步研究。

(来源:江苏农业科学   ISSN号:1002-1302   2020年16期)